考博生化和分子生物学复习笔记-第30部分
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的应用在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR 技术尚可应 用于基因拼接、测序等领域。 考点：PCR原理和应用 2。在生物界DNA合成的方式有几种？大肠杆菌及真核生物中有哪些DNA聚合酶及它们各有 何功能？（北医2000） 答案： DNA 合成有三种方式：（1）DNA复制。细胞增殖时，DNA 通过复制使遗传信息从亲代传递 到子代。（2）修复合成。DNA受到损伤后进行修复，需要进行局部的DNA的合成，用以保 证遗传信息的稳定遗传。（3）反转录合成。以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。原 核生物的DNA聚合酶有DNA polⅠ、DNA polⅡ和DNA polⅢ，DNA polⅢ是复制延长 中真正起催化作用的，除具有5′→3′聚合活性，还有3′→5′核酸外切酶活性和碱基选择功 能，能够识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用；DNA polⅠ具有5′→3′聚合活性、 3′→5′和5′→3′核酸外切酶活性，5′→3′核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段， 起切除、修复作用。另外，Klenow片断是DNA polⅠ体外经蛋白酶水解后产生的大片段， 具有DNA聚合酶和3′→5′外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。DNA polⅡ在无DN A polⅠ和 DNA polⅢ时起作用，也具有5′→3′和 3′→5′核酸外切酶活性。 真核细胞含有5种DNA聚合酶：α、β、γ、δ和ε。除了γ外，所有DNA聚合酶存在于 核内。DNA聚合酶α和δ在复制延长中起催化作用，DNA聚合酶α延长随从链，DNA聚 合酶δ延长领头链。DNA聚合酶β和ε在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。D NA 聚合酶 γ在线粒体中，用于线粒体DNA 的复制。真核细胞还有一种端粒酶，是一种逆 转录酶，由酶和含重复序列的RNA分子组成，它以自身的RNA分子为模板从随从链的3′ 端合成端区的DNA，使随从链延长，以防止随从链在每次复制时被缩短。 考点：DNA的生物合成，DNA聚合酶 3。什么叫限制性内切核酸酶？任举一例说明其应用。（北医 2000） 答案： 限制性内切核酸酶是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的 一类内切酶。限制性内切核酸酶存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限 制…修饰体系，限制外源DNA、保护自身DNA，对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。
限制性内切核酸酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性内切核酸酶为Ⅱ类酶，例如， EcoRI、BamHⅠ等就属于这类酶。Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称， 即回文结构，切断的双链DNA都产生5′磷酸基和3′羟基末端。 举例（举一例即可）：①可以识别DNA特定序列，切割DNA片段和载体，产生互补的粘性 末端，用于定向克隆。②通过单一或两种限制性内切核酸酶酶切插入了外源片段的载体，判 断外源片段是正向插入还是反向插入。③每种细菌和质粒都有特异的限制性内切核酸酶酶切 图谱，可用于粗略判断细菌或质粒的种类。④切割染色体DNA，用于构建基因文库。⑤限 制性片段长度多态性（RFLP）。检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大 小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA 的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。 考点：DNA重组的工具酶，限制性内切核酸酶 4。简述PCR 技术的基本原理及应用。（北医 1999） 答案： 基本原理：聚合酶链反应是一种DNA的体外扩增技术。其基本原理是以拟扩增的DNA分 子为模板，以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照 半保留复制的机制沿着模板链合成目的DNA的过程。反应体系的基本成分；模板DNA、 特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP、含镁离子的反应缓冲液。基本反应步骤：①变 性：反应系统加热至 95℃ ，使模板DNA双链解离。②退火：将温度下降至适宜位置，是 引物与模板DNA退火结合；③延伸：温度上升至 72℃ ，DNA聚合酶以dNTP为底物催 化DNA的合成反应。 PCR 的主要用途：①目的基因的克隆；②基因的体外突变；③DNA的微量分析。 考点：PCR概念原理和应用 5。写出几种DNA 合成方式的名称及其生物学意义；Eli 经UV照射后其DNA可能发生 哪些形式的损伤？可能通过哪些机制进行修复？（北医1999） 答案： DNA 分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA指导的 DNA合成，也称复制，是细胞 内DNA最主要的合成方式。遗传信息储存在DNA分子中，细胞增殖时，DNA通过复制使 遗传信息从亲代传递到子代。（2）修复合成，即DNA受到损伤（突变）后进行修复，需要进 行局部的DNA的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）RNA指导的DNA合成，即反 转录合成，是RNA病毒的复制形式，以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。 Eli 经 UV 照射后，同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个 T、 或两个C、或C与T间都可以环丁基环连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体。紫外 线照射还能引起DNA链断裂等损伤。 光修复。由光修复酶修复因紫外照射引起的嘧啶二聚体，使其还原。 切除修复。由UvrA、UvrB、UvrC、DNA pol Ⅰ、dNTP、连接酶参与。首先UvrA、Uv rB辨认损伤部位并与之结合，UvrC 切除损伤的 DNA，DNApolⅠ以dNTP 为原料，填实 切除空隙，最后由连接酶连接缺口，完成修复。 考点：DNA合成、损伤及修复 6。写出真核生物 mRNA的结构特点，简明叙述真核生物 mRNA 前体的加工过程。（北医 1 998） 答案： mRNA的结构特征：5′端有帽，即 5′…pmGpppG；3′端含多聚腺苷酸的尾；不含内含子； 个别核苷酸有甲基化修饰。 ①5′端加帽：5′端加帽，即把5′…pppG转变为5′…pmGpppG。其过程需磷酸解、磷酸化
和碱基的甲基化。 ②3′端加尾：polyA聚合酶识别mRNA的游离3′…OH端，并加上约200个A残基。 ③剪接：剪接加工能够切除内含子，把外显子连结在一起。剪接加工中，需要由多种snRN A 与蛋白质共同组成的并接体，基本过程为二次转酯反应。 ④甲基化修饰：在mRNA中存在甲基化核苷酸，位于5′端和非编码区。 ⑤mRNA编辑：插入、删除、或取代某些核苷酸，使mRNA获得正确的翻译功能。 考点：RNA转录后加工 7。解释：①ribozyme； ②molecular disease； ③cDNA； ④reverse transcriptase（北 医1998） 答案： ①核酶：具有催化功能（酶的作用）的RNA分子。核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结 构。 ②分子病：如果DNA分子的碱基发生变化，由它编码的蛋白质结构或量就发生相应的改变， 从而引起机体功能障碍的一类疾病称为分子病。例如运输性蛋白病、凝血及抗凝血因子缺乏 症、免疫蛋白缺陷病、膜蛋白病、受体蛋白病等。 ③cDNA：是指以mRNA或病毒RNA为模板，经反转录酶催化合成互补单链DNA，再聚 合生成的双链DNA。 ④反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，RNA指导的DNA聚合酶： RNA 酶；DNA指导的DNA聚合酶。即以 RNA 为模板，在反转录酶的催化下，合成与RN A 互补的 DNA 单链，形成杂化双链，反转录酶将其中 RNA链水解，在以互补的 DNA链为 模板，合成双链DNA。 考点：核酶，分子病，cDNA，反转录酶 8。原核生物蛋白质合成起始复合物由哪些成分组成？图示该复合物的形成过程。（北医 1997） 答案： 原核生物蛋白质合成起始复合物由甲酰蛋氨酰…tRNA（fMet…tRNAfMet）、mRNA和核蛋白 体大小亚基组成。步骤如下： ①核蛋白体大、小亚基分离。 ②30S亚基在IF3和IF1的促进下与mRNA的启动部位结合，在IF2的促进与IF1的辅 助下与fMet…tRNAfMet以及GTP结合，形成30S起动复合物。30S起动复合物由30S 亚基、fMet…tRNAfMet、mRNA和IF1、IF2、IF3、GTP组成。 ③30S起动复合物形成后，IF3即行脱落，50S亚基与30S起动复合物结合，形成70S 起动前复合物。70S起动前复合物由核蛋白体大小亚基、fMet…tRNAfMet、mRNA和IF1、 IF2、GTP 组成。 ④70S起动前复合物中的GTP水解释放出GDP和磷酸，IF1、IF2随之脱落，形成起动复 合物。完成蛋白质合成的起动步骤。 考点：蛋白质生物合成 9。①何谓不稳定碱基对？不稳定碱基对应于反密码子与密码子的哪个碱基配对？（北医 1997） ②写出Eli DNA聚合酶的亚基组成；叙述其中任二亚基功能，说明因子功能意义。 答案： mRNA密码子的前两位碱基和tRNA 的反密码严格配对。而 mRNA密码第三位碱基与 tR NA 反密码第一位碱基不严格遵守配对规则，称为密码配对的摆动性。这种配对的碱基对称 为不稳定碱基对。
原核生物的RNA聚合酶由多个亚基组成：α2ββ′称为核心酶，转录延长只需核心酶即可。 α2ββ′σ 称为全酶，转录起始前需要 σ 亚基辨认起始点。α 亚基可能与转录基因的类型和种 类有关，决定哪些基因被转录。β亚基具有促进聚合反应中磷酸二酯键生成的作用。β′亚基 是酶和模板结合时的主要部分。σ因子是原核生物RNA聚合酶全酶的成份，功能是辨认转 录起始区，识别位点在转录起始点上游—35bp处，称为—35区，共有序列为TTGACA。 σ 因子与核心酶的集合不紧密，转录起始完成后 σ 因子从 RNA 聚合酶全酶中脱落下来，由 核心酶催化RNA延长。 考点：密码配对的摆动性，RNA聚合酶 10。如不考虑生长条件，若使 Lac操纵子 O基因突变，可能会对 Lac基因表达产生什么影 响？为什么？ 答案：乳糖操纵子包括三个结构基因（Z、Y、A）、三个调节基因（启动基因、操纵基因和 CAP 蛋白结合位点），以及一个调节基因，调节基因编码阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵基因 结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。当乳糖存在时，乳糖的分解产物半乳糖与阻遏 蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵基因解离，诱导基因的转录。但是阻遏蛋白脱离操纵基因而 解除封闭后，如果没有CAP的作用也不能启动转录。细胞内葡萄糖缺乏、cAMP水平升高 时，cAMP与CAP结合形成复合物，并与CAP结合位点结合，可促进RNA聚合酶与启动 基因结合并启动转录。所以乳糖操纵子的诱导作用既需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。 根据以上原理，可知当操纵基因突变后，阻遏蛋白不能再结合操纵基因。因此即使没有乳糖 存在，只要有葡萄糖缺乏、cAMP水平升高的情况，细菌就会强制启动结构基因转录，生成 半乳糖酶。如果没有葡萄糖缺乏、cAMP水平升高的情况，细菌仍然不会启动半乳糖酶基因 的转录。 考点：乳糖操纵子 11。详尽解释“DNA 生物合成”的概念，写出参加DNA 复制的主要酶，蛋白因子及主要功能 答：DNA的生物合成包括：（1）DNA复制。细胞增殖时，DNA通过复制使遗传信息从亲 代传递到子代。（2）修复合成。DNA受到损伤后进行修复，需要进行局部的DNA的合成， 用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）反转录合成。以RNA为模板，由逆转录酶催化合成 DNA。 以原核生物DNA复制为例： ①复制起始点识别蛋白：在Eli，复制起始点称为oriC，具有特定结构能够被DnaA蛋 白辨认结合。 ②拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避 免DNA分子打结、缠绕、连环。复制完成后使DNA分子进入负超螺旋。 ③解螺旋酶：将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。 ④单链结合蛋白（SSB）：保持模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。 ⑤引物酶：催化合成引物。 ⑥DNA聚合酶：以DNA为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3 '…OH末端，合成互补的 DNA新链，即 5'→3'聚合活性。原核生物的DNA聚合酶有DNA polI、DNA pol II和 DNA pol III，DNA pol III是复制延长中真正起催化作用的，还 有3'→5'外切酶活性，识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用。DNA pol I用于切除 引物以及突变片段，起切除、修复作用。 ⑦DNA连接酶：连接双链中的单链缺口，使相邻两个DNA片段的3'…OH末端和5'…P末端
形成3，5磷酸二酯键。 考点：DNA的生物合成，DNA复制所需酶类 自测题及模拟训练 一、DNA合成部分 （一）单项选择题 1、Meselson 和 Stahl 利用 15N及14N 标记大肠杆菌的实验证明了 A。 DNA 能被复制D。 DNA 可表达为蛋白质 B。 DNA 可转录为mRNAE。 DNA 的半保留复制机制 C。 DNA的全保留复制机制 2、合成 DNA的原料是 A。 dATP； dGTP； dCTP；dTTPD。 ATP； GTP； CTP； UTP B。 ADP； dGDP； dCDP；dTDPE。 AMP； GMP； CMP； UMP C。 dAMP； dGMP； dCMP； dTMP 3、参与打开 DNA超螺旋结构过程的酶是 A。 解链酶B。 拓扑异构酶 IC。 DNA 结合蛋白 D。 引发前体E。 拓扑异构酶 II 4、DNA复制时； 以序列 5＇…TpApGpAp…3＇为模板合成的互补结构是 A。 3＇…TpCpTpAp…5＇D。 5＇…GpCpGpAp…3＇ B。 5＇…ApTpCpTp…3＇E。 5＇…TpCpTpAp…3＇ C。 5＇…UpCpUpAp…3＇ 5、关于真核生物DNA 复制与原核生物相比； 说法不正确的是 A。复制起始点只有一个 D。 引物长度较短 B。 冈崎片段长度较短 E。 由DNA 聚合酶α 及 δ催化核内DNA的合成 C。 复制速度较慢 6、关于哺乳类动物DNA复制叙述错误的是 A。 RNA 引物较小 D。 DNA聚合酶 δ和α 参与 B。 冈崎片段较小 E。 片段连接时由 ATP 供给能量 C。 仅有一个复制起始点 7、在DNA 复制中RNA引物的作用是 A。 使 DNA聚合酶III 活化 D。提供3＇…OH末端作合成新 DNA链起点 B。 使 DNA双链解开E。 提供3＇…OH末端作合成新RNA链起点 C。 提供 5＇…末端作合成新DNA 链起点 8、关于 DNA聚合酶的错误说法是 A。 底物都�
